Senin, 16 November 2009

Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
Menggunakan Transformasi Agrobacterium
Syamsidah Rahmawati
Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Bogor KM 46, Cibinong 16911
ABSTRACT
Development Status of Rice Genetic Improvement using
Agrobacterium Transformation. Syamsidah Rahmawati.
Genetic transformation of rice becomes an important research
area in recent years. Rice is staple food for almost
half of world population and has been extensively used as a
plant model system for monocotyledonous plant. Compare
to direct DNA transfer techniques (PEG, electroporation, and
DNA bombardment), Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation was considered to be more advantageous
because it is easy to handle, integration and segregation
pattern are more predictable, and the likelihood to get transgenic
plant with low copy number is high, thus decreasing
gene silencing phenomena. Various important genes have
been introduced into rice genome via Agrobacterium
transformation. A number of important factors affecting the
Agrobacterium transformation and the application of this
technique in the next future will be discussed.
Key words: Rice, genetic improvement, Agrobacterium
transformation.
PENDAHULUAN
Padi merupakan komoditi penting karena merupakan
makanan pokok hampir setengah penduduk
dunia di mana sebagian besar berasal dari negara berkembang
termasuk Indonesia. Penyediaan beras bagi
penduduk dunia yang tumbuh pesat merupakan tantangan
berat. Ketersediaan pangan harus dipenuhi dalam
kondisi di mana lahan subur berkurang setiap tahun,
ketersediaan air terbatas, dan ada serangan hama
penyakit. Untuk mengantisipasi ketersediaan dan
menjaga ketahanan pangan secara berkesinambungan
perlu dikembangkan varietas tanaman yang mempunyai
kemampuan adaptasi yang baik dengan daya
hasil tinggi, kualitas biji dan kandungan nutrisi baik,
serta tahan terhadap cekaman hama penyakit.
Upaya perbaikan sifat-sifat penting tanaman
telah dimulai sejak manusia mengenal cara bercocok
ta-nam dengan melakukan persilangan dan seleksi
be-nih. Penemuan gen, yaitu penentu sifat yang
diwaris-kan pada turunan berikutnya oleh Gregor
Mendel pada tahun 1866 dilanjutkan dengan berbagai
penemuan berikutnya di mana gen dapat diisolasi,
Hak Cipta  2006, BB-Biogen
ditransfer, dan diekspresikan dalam sel lain telah
membuka peluang yang besar dalam upaya
perbaikan sifat genetik ta-naman. Penerapan
teknologi transfer gen ini memung-kinkan penyisipan
hanya gen-gen penting saja, sehing-ga sifat lain
diharapkan tidak berubah.
Pada tanaman padi, secara garis besar ada dua
teknik transfer gen yang telah berhasil diterapkan,
yaitu transfer gen secara langsung (misalnya dengan
senyawa kimia polyethylene glycol (PEG), alat elektroporator,
atau penembak DNA), atau secara tidak langsung
dengan menggunakan bantuan bakteri tanah
Agrobacterium tumefaciens (Slamet-Loedin 1994). Masing-
masing teknik memiliki kelemahan dan
keunggul-an. Namun, adanya kecenderungan teknik
transfer DNA secara langsung menyisipkan DNA
dengan jum-lah salinan yang banyak menyebabkan
teknik transfor-masi Agrobacterium menjadi alternatif
pilihan. Sema-kin banyak jumlah salinan gen yang
disisipkan maka ekspresi gen kurang stabil akibat dari
adanya pem-bungkaman gen dan proses penyusunan
kembali (rearrangement) semakin tinggi yang
mengakibatkan ekspresi gen kurang stabil (Dai et al.
2001).
Teknik transformasi Agrobacterium memiliki keunggulan,
antara lain (1) efisiensi transformasi dengan
salinan gen tunggal lebih tinggi dan (2) dapat dilakukan
dengan peralatan laboratorium yang sederhana.
Gen dengan salinan tunggal lebih mudah dianalisa
dan biasanya bersegregasi mengikuti pola pewarisan
Mendel. Namun, keberhasilan transformasi Agrobacterium
masih terbatas pada genotipe tanaman tertentu.
Secara alami A. tumefaciens hanya menginfeksi
tanaman dari kelompok dikotil (biji berkeping dua),
sehingga keberhasilan transformasi Agrobacterium pada
awalnya hanya terbatas pada kelompok tanaman
dikotil. Penelitian secara intensif dan mendasar telah
membuahkan pemahaman yang baik mengenai biologi
dan mekanisme transfer gen A. tumefaciens.
Keberhasilan transformasi gen pada tanaman padi
(monokotil) menggunakan Agrobacterium pertama
kali dilaporkan oleh Hiei et al. (1994;1997). Manipulasi
berbagai faktor penting menentukan keberhasilan
transformasi. Saat ini berbagai kultivar tanaman padi
telah berhasil ditransformasi menggunakan Agro-
Jurnal AgroBiogen 2(1):36-44
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
37
bacterium (Toki 1997; Yara et al. 2001; Saharan et al.
2004).
Di Indonesia, penelitian mengenai manipulasi
ge-netik padi telah dimulai sejak tahun 1995. Pada
awal-nya teknik transfer gen yang digunakan adalah
penem-bakan DNA. Baru pada tahun 1996 mulai
dirintis pe-ngembangan sistem transformasi
Agrobacterium untuk padi jenis indica dan javanica
yang banyak ditanam di Indonesia (Slamet-Loedin et
al. 1997a), namun hingga saat ini hanya padi kultivar
Rojolele yang sudah berhasil ditransformasi.
Beberapa gen terutama untuk ketahanan terhadap
hama penggerek batang kuning, penyakit yang
disebabkan oleh jamur, dan toleran ke-keringan telah
berhasil disisipkan dan sedang dieva-luasi ekspresi
dan fungsinya. Transformasi genetika sangat penting
dan merupakan alternatif pilihan dalam mengatasi
masalah-masalah yang tidak dapat diatasi dengan
teknik pemuliaan tanaman.
Di dalam tulisan ini akan dibahas mengenai penerapan
teknik transformasi Agrobacterium untuk
memperbaiki sifat genetik tanaman padi, aspek penting
yang mempengaruhi keberhasilan transformasi,
gen yang telah berhasil diintroduksi pada tanaman padi,
dan prospek pemanfaatan teknik ini di masa yang
akan datang.
BIOLOGI DAN MEKANISME TRANSFORMASI
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
A. tumefaciens merupakan bakteri tanah gram
positif yang bersifat fitopatogen pada tanaman dikotil.
Bakteri ini, secara alami mempunyai kemampuan untuk
mentransfer potongan DNA-nya yang kemudian dikenal
dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom
tanaman dan menyebabkan terbentuknya tumor
(crown gall). Tumor ini merupakan mesin penghasil
makanan atau sebagai sumber karbon bagi
Agrobacte-rium.
Ada tiga komponen genetik penting terlibat dalam
proses pembentukan tumor. Pertama, gen virulen
kromosom (chromosomal virulence disingkat chv),
yang terdapat pada kromosom Agrobacterium dan
berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman.
Kedua, sekelompok gen virulen (vir) yang terdapat
dalam plasmid Ti yang berukuran besar (∼200 kb)
yang berperan dalam menginduksi transfer dan
integrasi T-DNA. Dan komponen ketiga adalah daerah
T-DNA yang juga terletak pada plasmid Ti. Daerah
T-DNA, dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right
border), mengandung gen penting bagi
Agrobacterium. Di dalam T-DNA terdapat gen iaaH,
iaaM, dan ipt yang menyandikan enzim-enzim penting
dalam biosintesis auksin dan sitokinin, yaitu zat
penting untuk pembe-lahan sel, sehingga terjadi
pembelahan sel yang tidak terkontrol dan
menyebabkan terbentuknya tumor. Di samping itu, TDNA
juga mengandung gen yang ber-peran dalam
sintesis dan sekresi opin yang penting untuk
dikonsumsi oleh Agrobacterium.
Bakteri masuk ke dalam jaringan tanaman melalui
luka. Jaringan tanaman dikotil yang terluka
meng-hasilkan senyawa fenolik (asetosiringon) dan
monosa-karida (glukosa, galaktosa) yang
menginduksi trans-kripsi sederetan gen vir dan
berakhir dengan penyisip-an gen-gen yang ada pada
daerah T-DNA. Mekanisme integrasi T-DNA ke dalam
genom tanaman secara mendetail dapat dilihat dalam
tulisan Tinland (1996), Sheng dan Citovsky (1996),
atau de la Riva et al. (1998). Mekanisme transfer gen
oleh bakteri A. tumefa-ciens dirangkum pada Gambar
1.
Kemampuan Agrobacterium ini kemudian
diman-faatkan untuk menyisipkan gen bermanfaat ke
dalam tanaman. Selanjutnya gen-gen yang berperan
dalam sintesis hormon dan opin dihilangkan dan
diganti de-ngan gen bermanfaat untuk perbaikan sifat
tanaman. Berdasarkan hasil penelitian Hoekema et al.
(1984) di-ketahui bahwa T-DNA dapat ditransfer
meskipun ter-letak pada plasmid yang berbeda.
Penemuan inilah yang mendasari penggunaan sistem
plasmid ganda (binary vector). Dibandingkan dengan
sistem yang la-ma (cointegrate), sistem vektor biner
adalah yang pa-ling banyak digunakan saat ini karena
plasmid yang mengandung T-DNA menjadi lebih kecil
dan lebih mu-dah dimanipulasi secara in vitro. Dalam
sistem ini di-gunakan dua vektor (Gambar 2), satu
mengandung kelompok gen vir (plasmid Ti) dan
vektor lain me-ngandung T-DNA dengan gen yang
disisipkan (Walkerpeach dan Velten 1994).
Selanjutnya, penam-bahan gen virG pada plasmid
biner dilaporkan dapat meningkatkan efisiensi
transformasi. Plasmid biner yang mendapat tambahan
gen vir ini disebut sebagai plasmid super biner (super
binary vector) (Torisky et al. 1997).
FAKTOR PENTING YANG MEMPENGARUHI
KEBERHASILAN TRANSFORMASI AGROBACTERIUM
Genotipe dan Jaringan Tanaman/Eksplan
Azhakanandam et al. (2000) melaporkan bahwa
keberhasilan transformasi Agrobacterium sangat bergantung
pada genotipe tanaman padi yang digunakan
sebagai materi penelitian tidak peduli apakah dari
kelompok japonica, indica atau javanica. Beberapa
genotipe padi sangat sulit ditransformasi dengan AgroJURNAL
AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
38
bacterium. Hal ini merupakan salah satu keterbatasan
penggunaan transformasi Agrobacterium. Genotipe
yang sangat responsif terhadap kultur jaringan cenderung
memberikan respon yang baik terhadap transformasi.
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
39
Gambar 1. Mekanisme transfer gen ke dalam tanaman oleh A. tumefaciens. Tahapan penting yang terjadi selama proses
transfer gen dijelaskan secara ringkas pada kotak 1-13. Beberapa tahapan masih belum diketahui secara pasti
(diberi tanda ?) atau baru merupakan hipotesis.
Sumber: de la Riva et al. (1998).
Gambar 2. Sistem vektor biner. Plasmid A dan B komplemen satu sama lain apabila keduanya berada
pada satu sel A. tumefaciens. T-DNA yang terdapat pada plasmid B akan ditransfer ke dalam
sel tanaman oleh protein yang disandi plasmid A.
DNA kromosom
Sel Agrobacterium tumefaciens
A
pTi
~ 170 kb
Daerah virulen
Daerah spesifisitas
inang
B
~ 20 kb
T-DNA
Daerah pemotongan
spesifik
chvA chvB
p
chvE
JURNAL AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
40
Di samping pemilihan genotipe tanaman, pemilihan
jaringan juga menentukan keberhasilan transformasi.
Jaringan yang baik digunakan sebagai bahan
transformasi adalah jaringan yang memberikan
respon yang baik terhadap kultur jaringan. Dari
berbagai ja-ringan (ujung tunas, akar, skutellum,
embrio yang be-lum masak, kalus yang diinduksi dari
akar dan sku-tellum, serta kultur suspensi sel yang
diinduksi dari skutellum) yang telah dicoba, kalus dari
jaringan sku-tellum benih masak menghasilkan
jumlah transforman paling tinggi (23%) (Hiei et al.
1994) sehingga paling banyak digunakan hingga saat
ini. Ukuran skutelum dapat mempengaruhi efisiensi
transformasi dengan meningkatkan kemampuan
pembentukan kalus em-briogenik secara nyata
(Slamet-Loedin et al. 1997b). Pemilihan genotipe yang
sistem regenerasinya sudah diketahui dengan baik
merupakan tahap awal yang menentukan
keberhasilan transformasi.
Strain Agrobacterium dan Plasmid/Vektor
Pemilihan strain Agrobacterium dan vektor
sangat mempengaruhi efisiensi transformasi. Salah
satu kele-mahan transformasi Agrobacterium adalah
terbatas-nya tanaman inang yang dapat diinfeksi.
Penggunaan A. tumefaciens yang super virulen
seperti, EHA 101, EHA 105, AGL1 dikombinasikan
dengan vektor biner atau A. tumefaciens strain biasa
(LBA 4404) dikombi-nasikan dengan vektor super
biner ditujukan untuk memperluas inang tanaman
yang dapat diinfeksi. Azhakanandam et al. (2000)
melaporkan bahwa A. tumefaciens strain LBA4404
yang membawa vektor super-biner (pTOK233 dengan
ekstra gen virB, C, dan G) sangat efektif
mentransformasi padi baik kelompok japonica,
indica, dan javanica dibandingkan dengan vektor
biner pTOK233 tanpa penambahan ekstra gen vir.
Asetosiringon dan pH
Senyawa fenolik asetosiringon merupakan sinyal
transkripsi gen vir yang berperan dalam mekanisme
transfer gen. Penambahan asetosiringon sangat penting
untuk transformasi tanaman padi karena tanaman
padi tidak menghasilkan asetosiringon. Tanpa penambahan
asetosiringon transformasi tidak akan berhasil
meskipun menggunakan strain yang super virulen
atau vektor super biner (Rashid et al. 1996).
Konsentrasi optimum dan umum digunakan dalam
transformasi Agrobacterium adalah 100 μM. Namun,
untuk transfor-masi padi rekalsitran (misalnya padi
dari kelompok Indica HKR-46 dan -126) penambahan
asetosiringon konsentrasi tinggi (400 μM) pada media
pertumbuhan Agrobacterium dan ko-kultivasi perlu
dilakukan untuk meningkatkan keberhasilan
transformasi (Saharan et al. 2004). Selain itu, kondisi
pH juga mempengaruhi ekspresi gen vir. Meskipun
gen vir dapat diekspresikan pada pH 5,0-5,8, kondisi
pH 5,2 adalah yang paling baik dan umum digunakan.
Kondisi Infeksi dan Ko-kultur
Berbagai modifikasi dilakukan pada saat prainfeksi,
infeksi, dan ko-kultivasi untuk meningkatkan
efisiensi transformasi. Sebelum inokulasi, Agrobacterium
ditumbuhkan pada media YEP atau media AB
yang mengandung asetosiringon. Konsentrasi bakteri
yang digunakan bervariasi antara 0,5-2 pada OD600
(Azhakanandam et al. 2000; Dai et al. 2001; Saharan et
al. 2004). Bakteri yang digunakan untuk menginfeksi
sel tanaman sebaiknya bakteri yang sedang tumbuh
aktif (fase logaritmik). Bakteri yang sudah ditumbuhkan
selama satu malam disubkultur dan ditumbuhkan
kembali selama 2-3 jam hingga mencapai kerapatan
sel yang diinginkan (OD600 = 0,4-0,5). Pada
konsentrasi yang lebih tinggi, populasi bakteri lebih
padat pada kalus sehingga menyulitkan saat
pencucian kalus.
Selain faktor kerapatan sel, perendaman kalus
dalam suspensi Agrobacterium selama 25 menit ditambah
perlakuan vakum selama 5 menit dapat meningkatkan
efisiensi transformasi (Mafthuchah et al.
2002).
Antibiotik untuk Eliminasi Agrobacterium
Setelah ko-kultivasi biasanya Agrobacterium dieradikasi
dengan merendam kalus dalam larutan antibiotik.
Selanjutnya kalus ditanam pada media seleksi
yang selain mengandung agen penyeleksi juga mengandung
antibiotik. Bahkan terkadang penggunaan
antibiotik dilanjutkan pada media regenerasi (Yara et
al. 2001) untuk menghindari berkembangnya
Agrobac-terium. Kejadian di mana bakteri tidak
terdeteksi se-lama di media seleksi yang mengandung
antibiotik, namun muncul kembali setelah
dipindahkan pada media regenerasi yang tidak
mengandung antibiotik kadang terjadi.
Masing-masing strain Agrobacterium mempunyai
sensitivitas yang berbeda-beda terhadap antibiotik
(Alsheikh et al. 2002), sehingga perlu pengujian awal
untuk menentukan jenis dan konsentrasi antibiotik
yang sesuai untuk membunuh Agrobacterium yang
digunakan. Antibiotik yang umum digunakan untuk
mengeliminasi Agrobacterium adalah carbenicilin dan
cefotaxim. Keduanya termasuk kelompok β-laktam
yang menghambat pembentukan dinding sel bakteri.
Namun, carbenicilin sensitif terhadap enzim β-laktamase
yang dihasilkan oleh bakteri sehingga kurang
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
41
efektif dalam mengeliminasi Agrobacterium pasca kokultivasi.
Sebaliknya, cefotaxime bersifat lebih resisten
terhadap β-lactamase, namun dapat menghambat
per-tumbuhan kalus, regenerasi tanaman dan mempengaruhi
efisiensi transformasi (Ling et al. 1998).
Tang et al. (2000) membandingkan efektifitas dari 4
jenis antibiotik (ampicilin, carbenicilin, cefotaxime,
dan timentin) pada berbagai konsentrasi (100–1000
mg/l) terhadap A tumefaciens strain C58C1 ATHV RifR
(derivatif dari EHA 101). Timentin merupakan kombinasi
antibiotik ticarcilin (golongan β-lactam) dengan
inhibitor β-laktamase asam klavulanat. Hasil pengujian
tersebut menunjukkan bahwa timentin (500 mg/l) paling
efektif mengeliminasi A. tumefaciens strain C58C1
dan tidak berpengaruh negatif terhadap regenerasi tanaman.
Kelebihan timentin lainnya adalah lebih toleran
terhadap cahaya. Namun sayang, jenis antibiotik
ini sulit ditemukan di Indonesia. Alternatif lain adalah
dengan pengeringan sel atau jaringan tanaman secara
perlahan pasca infeksi. Cheng et al. (2003) melaporkan
bahwa pengeringan dapat menekan
pertumbuhan Agrobacterium dan meningkatkan
efisiensi transfor-masi.
Media Induksi, Ko-kultivasi, dan Regenerasi
Media dasar yang umum digunakan untuk induksi
kalus, ko-kultivasi, dan seleksi adalah N6 sedangkan
untuk media regenerasi adalah media MS (Hiei et al.
1994; Rashid et al. 1996; Toki 1997; Yara et al. 2001;
Cao et al. 2004). Penambahan casamino acids dan
prolin dilaporkan dapat meningkatkan kemampuan
re-generasi tanaman dan dapat menghasilkan
tanaman transgenik dalam waktu 2 bulan sejak
induksi kalus (Toki 1997). Kemampuan regenerasi
yang sama (12-31%) juga diperoleh pada tiga
subspesies padi japo-nica, indica, dan javanica
menggunakan media dasar LS untuk induksi kalus,
ko-kultivasi, dan seleksi (Azha-kanandam et al. 2000;
Slamet-Loedin et al. 1997a). Kemampuan regenerasi
pasca transformasi pada beberapa kultivar padi
sangat menurun akibat adanya kecenderungan
nekrosis. Dey et al. (2003) melaporkan bahwa
penambahan antinecrotic (40 mg/l L-cystein, 5 mg/l
perak nitrat, dan 15 mg/l ascorbic acid) dapat
mengurangi necrosis pasca infeksi Agrobacterium dan
meningkatkan kemampuan regenerasi tanaman. Penambahan
bahan pemadat phytagel 0,2% pada media
induksi kalus dan 0,5% pada media regenerasi meningkatkan
jumlah kalus embriogenik dan kemampuan
regenerasi berbagai kultivar tanaman padi baik
dari kelompok javanica, japonica, dan indica (Slamet-
Loedin et al. 1997b). Penggunaan phytagel lebih ekonomis
dibandingkan dengan agarose tipe I (Sigma)
yang umum digunakan pada kultur jaringan tanaman
padi karena selain harganya jauh lebih murah pemakaiannya
juga lebih sedikit.
Bahan Penyeleksi
Higromisin (hpt) dan fosfinotrisin (bar) merupakan
dua agen penyeleksi yang digunakan secara luas
pada tanaman padi (Hiei et al. 1994; Rashid et al.
1996; Toki 1997; Yara et al. 2001; Vain et al. 2003;
Saharan et al. 2004; Jin et al. 2004). Konsentrasi yang
umum digu-nakan adalah 50 mg/l higromisin atau 5
mg/l fosfinotri-sin. Namun pada konsentrasi ini
terkadang masih memungkinkan adanya tanaman
yang escape, yaitu tanaman tahan higromisin atau
fosfinotrisin tapi tidak mengandung gen target.
Berdasarkan pengalaman di laboratorium,
peningkatan konsentrasi agen penyelek-si secara
bertahap dapat menekan munculnya tanam-an
escape. Kanamisin (nptII) atau G418 juga dapat digunakan
sebagai agen penyeleksi pada padi, namun
penggunaannya sangat terbatas karena dilaporkan
dapat menghambat pertumbuhan sel (Azhakanandam
et al. 2000).
Ekspresi dan Stabilitas Gen
Gen yang disisipkan ke dalam genom tanaman
harus dapat diekspresikan sehingga menghasilkan
protein yang diinginkan serta harus stabil diwariskan
ke generasi berikutnya. Gen-gen yang diekspresikan
pada tanaman, pada awalnya, adalah gen-gen asli dari
sumbernya (bakteri, jamur, hewan, tanaman), namun
kebanyakan ekspresi dari gen tersebut di dalam tanaman
sangat rendah. Hal ini antara lain disebabkan
oleh penggunaan kodon yang tidak sesuai. Oleh karena
itu, modifikasi, penggunaan kodon yang sesuai dengan
tanaman target telah umum dilakukan untuk
meningkatkan ekspresi gen di dalam tanaman. Selain
itu, penambahan enhancer dikombinasikan dengan
penggunaan promoter kuat atau promoter spesifik dapat
meningkatkan ekspresi gen pada tanaman.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa apabila
gen telah terintegrasi pada genom tanaman,
maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi
berikutnya. Hiei dan Komari (1996) melaporkan bahwa
transgen stabil diwariskan hingga generasi ke-4.
Hal yang sama juga dilaporkan oleh Wu et al. (2002)
di mana transgen stabil diwariskan hingga generai ke-
6. Namun, Rashid et al. (1996) melaporkan tentang
ada-nya kemungkinan terjadinya pembungkaman
gen. Pembungkaman gen adalah salah satu fenomena
yang menyebabkan terjadinya kegagalan dalam
mengeks-presikan gen. Hingga saat ini, mekanisme
yang menye-babkan terjadinya ketidakstabilan
JURNAL AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
42
integrasi dan eks-presi gen masih belum jelas
dimengerti. Cao et al. (2004) menyarankan
penggunaan promoter yang ber-beda untuk masingmasing
kaset ekspresi, untuk menghindari terjadinya
pembungkaman gen pada tahap transkripsi
(transcriptional silencing).
GEN YANG TELAH BERHASIL DIINTRODUKSI KE
DALAM GENOM TANAMAN PADI MENGGUNAKAN
TRANFORMASI AGROBACTERIUM
Saat ini berbagai gen bermanfaat telah berhasil
disisipkan ke dalam berbagai kultivar tanaman padi
baik sebagai gen tunggal maupun gen ganda dengan
menggunakan transformasi Agrobacterium. Pada
awalnya introduksi hanya terbatas pada gen-gen penyandi
sifat ketahanan terhadap hama atau penyakit,
yang dianggap sangat menguntungkan pengusaha
tani. Namun beberapa tahun terakhir ini telah dikembangkan
tanaman padi yang memiliki sifat yang
meng-untungkan bagi konsumen. Golden rice, yaitu
beras yang berwarna kuning keemasan karena
mengekspre-sikan pro-vitamin A β-karoten (Ye et al.
2000) dan beras kaya akan kandungan zat besi (Goto
et al. 1999) adalah dua contoh populer upaya
perbaikan nutrisi padi.
Saat ini, pencarian gen-gen yang berperan dalam
menentukan sifat tahan kekeringan (kekurangan air),
dan introduksi gen tersebut ke dalam genom padi,
serta evaluasi ketahanan tanaman transgenik, sedang
giat dilakukan. Hal ini dilakukan untuk mengantisipasi
keadaan di mana ketersediaan lahan subur yang semakin
berkurang. Selain itu, juga ada upaya pemanfaatan
sel tanaman padi untuk produksi bahan obat,
meskipun mendapat banyak tantangan dari berbagai
kalangan. Berbagai gen yang telah berhasil diintroduksi
ke dalam genom tanaman padi disajikan pada
Tabel 1.
PROSPEK
Tanaman padi transgenik yang mengandung berbagai
gen penting seperti gen tahan penggerek
batang, penyakit blas, hawar daun, kekeringan,
salinitas, dan herbisida. Di samping itu juga dihasilkan
tanaman padi dengan daya hasil tinggi, dan
kandungan zat besi dan vitamin A tinggi
menggunakan transformasi Agrobac-terium. Saat ini,
transformasi Agrobacterium sudah di-manfaatkan
lebih luas pada berbagai kultivar tanaman padi
kelompok japonica, indica maupun javanica.
Meskipun demikian tidak semua genotipe padi
berhasil ditransformasi menggunakan teknik transformasi
Agrobacterium yang dikembangkan saat ini.
Beberapa kultivar padi komersial, seperti IR64 dan
Tabel 1. Beberapa gen yang telah diintroduksi ke dalam tanaman menggunakan transformasi Agrobacterium.
Gen Asal Promoter Sifat sasaran Varitas padi Pustaka
cryIAb, cryIAc Bacillus thuringiensis Ubi, CaMV 35S,
Brassica Bp10
Tahan PBK dan PBP Nipponbare
(Japonica)
Cheng et al. (1998)
ferritin Kedelai GluB-1 Padi mengandung zat
besi dan zink
Indica (IR68144) Goto et al. (1999);
Vasconcelos et al. (2003)
psy, lyc, crt1 Bunga daffodil
Bakteri Erwinia
uredovora
Gt1, 35S CaMV
35S CaMV
Padi mengandung provitamin
A
Japonica (TP 309) Ye et al. (2000)
rhLF (lactoferrin) Manusia Ubiquitin jagung Padi mengandung
lactoferin
Javanica (Rojolele) Rachmawati et al. (2004)
ech42, nag70, glue48 Trichoderma atriviride Act1 Tahan Rhizoctonia
solani dan Magnaporte
grisea
Ishikari-shiroge
(Japonica)
Mei et al. (2004)
cryIB-cryIAa hybrid Bt Ubiquitin jagung Tahan PBK Javanica (Rojolele) Rahmawati dan Slamet-
Loedin (2004)
VHb dan EPSPS Bakteri Vitreoscilla dan
Salmonella typhimurium
Pistil spesifik dari
kentang dan
CaMV35S
Hasil tinggi dan tahan
herbisida
Japonica (Xiushui-11,
Qiufeng, Youfeng,
dan Hanfeng)
Cao et al. (2004)
chitinaseI Padi CaMV Tahan jamur penyebab
blas Magnaporthe
grisea dan Rhizoctonia
solani
Indica (vaidehi, tulsi) Nishizawa et al. (1999)
Hva1 Barley Promoter
terinduksi ABA,
Promoter
konstitutive
actin1 padi
Osmoprotektan Indica (Basmati) Rohila et al. (2002)
otsA-otsB, Bakteri E. coli Promoter
terinduksi ABA
dan stres, rbcS
Tahan salinitas dan
kekeringan
Indica (PB-1) Garg et al. (2002)
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
43
IR72 sangat rekalsitran terhadap transformasi
Agrobac-terium. Ditambah lagi tidak semua kultivar
dapat disil-angkan satu sama lain. Namun, dengan
adanya upaya pengembangan vektor super biner baru
(Toki 1997; Cao et al. 2004) yang lebih efektif ataupun
pengem-bangan sistem vektor biner rangkap (Vain et
al. 2003) dikombinasikan dengan penggunaan strain
Agrobac-terium yang sesuai, maka penggunaan
transformasi Agrobacterium akan lebih luas lagi di
masa menda-tang.
Keberhasilan penggunaan sistem vektor biner
rangkap akan sangat bermanfaat dalam upaya introduksi
multi gen di mana ukuran DNA yang disisipkan
dapat lebih banyak dan besar. Seperti sudah diketahui
bahwa beberapa sifat, seperti tahan kekeringan dan
daya hasil tinggi, ditentukan oleh banyak gen. Kebanyakan
dari gen-gen yang berperan dalam menentukan
sifat toleran kekeringan dan daya hasil tinggi belum
berhasil diidentifikasi hingga saat ini. Penemuan
gen-gen penentu sifat-sifat penting tersebut disertai
de-ngan penguasaan teknik transformasi yang tepat
di-harapkan dapat memenuhi kebutuhan pangan
yang akan terus meningkat.
Salah satu pendekatan yang lazim digunakan
saat ini untuk menemukan, mengisolasi, dan
identifikasi gen-gen yang menentukan sifat penting
pada tanaman adalah dengan membuat tanaman
mutan. Tanaman mutan dihasilkan dengan
menginsersikan elemen transposon (di antaranya
Ac/Ds) menggunakan trans-formasi Agrobacterium.
Dalam proses menghasilkan tanaman mutan tersebut,
penerapan teknik trans-formasi Agrobacterium lebih
menguntungkan karena dapat menghasilkan tanaman
yang mengandung salin-an gen tunggal dengan
efisiensi tinggi. Analisis tanam-an dengan jumlah
salinan gen tunggal lebih mudah dilakukan, sehingga
tanaman mengandung gen target dengan salinan
tunggal sangat diperlukan dalam studi biologi
molekuler dan dalam mempelajari fungsi gen
(functional genomic).
KESIMPULAN
Saat ini transformasi Agrobacterium telah
berhasil dilakukan pada berbagai kultivar padi
japonica, indica dan javanica. Pemilihan genotipe,
jaringan tanaman, umur eksplan, strain
Agrobacterium, vektor, konsentra-si asetosiringon dan
pH, kerapatan sel bakteri, lama dan suhu kokultivasi,
antibiotik, bahan penyeleksi, komposisi media kultur,
sangat penting dalam menen-tukan keberhasilan
transformasi. Pada beberapa ta-naman yang sangat
rekalsitran penggunaan konsen-trasi asetosiringon
dan bahan pemadat yang tinggi, pengeringan kalus
secara perlahan atau penambahan antinekrotik pasca
ko-kultivasi dapat meningkatkan efisiensi transformasi
secara nyata. Selain itu, pemi-lihan promoter,
penggunaan kodon yang sesuai, pe-nambahan
enhancer dapat meningkatkan ekspresi gen di dalam
tanaman. Saat ini berbagai gen, tunggal maupun
poligenik, telah berhasil diintroduksi ke dalam
tanaman padi dalam upaya perbaikan mutu genetik
padi dan dilaporkan stabil diturunkan ke gene-rasi
berikutnya. Kemampuan transformasi Agrobacte-rium
menghasilkan tanaman transgenik dengan salin-an
gen tunggal akan banyak dimanfaatkan untuk
mempelajari fungsi berbagai gen penting tanaman
padi pada masa mendatang.
DAFTAR PUSTAKA
Alsheikh, M.K., H.P. Suso, M. Robson, N.H. Battey, and A.
Watten. 2002. Appropriate choice of antibiotic and
Agrobacterium strain improves transformation of antibiotic-
sensitive Fragaria vesca and F.V. semperflorens.
Plant Cell Rep. 20:1173-1180.
Azhakanandam, K., M.S. McCabe, J.B. Power, K.C. Lowe,
E.C. Cocking, and M.R. Davey. 2000. T-DNA transfer,
integration, expression and inheritance in rice: Effects of
plant genotype and Agrobacterium super-virulence. J.
Plant Physiol. 157:429-439.
Bizily, S.P., C.L. Rugh, R.B. Maegher. 2000. Phytodetoxification
of hazardous organomercurials by genetically
engineered plants. Nat. Biotechnol. 18:213-217.
Cao, M.X., J.Q. Huang, Z.M. Wei, Q.H. Yao, C.Z. Wan, and
J.A. Lu. 2004. Engineering higher yield and herbicide
resistance in rice by Agrobacterium-mediated multiple
gene transformation. Crop Sci. 44:2206-2213.
Cheng, X., R. Sardana, H. Kaplan, and I. Altosaar. 1998.
Agrobacterium-transformed rice plants expressing
synthetic cryIAb and cryIAc genes are highly toxic to
striped stem borrer and yellow stem borrer. Appl. Biol.
Sci. 95(6):2767-2772.
Cheng, M., T. Hu, L. Jeanne, L. Chong-Nong, and E.F.
Joyce. 2003. Desiccation of plant tissues post-Agrobacterium
infection enhances T-DNA delivery and increases
stable transformation efficiency in wheat. In
Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 39(6):595-604.
Cohen, M.B. 2000. Bt rice: Practical steps to sustainable
use. International Rice Research Notes 25(2):4-10.
Dai, S., P. Zheng, P. Marmey, S. Zhang, W. Tian, S. Chen,
R.N. Beachy, and C. Fauquet. 2001. Comperative
analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-
mediated transformation and particle bombardment.
Mol. Breed. 7:25-33.
de la Riva, A.G., J. Gonzalez-Cabrera, R. Vazquez-
Padron, and C. Arya-Pardo. 1998. Agrobacterium
tumefaciens: A natural tool for plant transformation.
JURNAL AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
44
Electronic Journal of Biotechnology 1(3) issue of
Dec 15.
Dey, M., H. Jiang, and R. Wu. 2003. Antinecrotic substances
improved regeneration frequency of transgenic
rice. Rice Genetics Newsletter 19:82-84.
Garg, A.K., J-K Kim, T.G. Owens, A.P. Ranwala, Y.D.
Choi, L.V. Kochian, and R.J. Wu. 2002. Trehalose
accumulation in rice plants confers high tolerance levels
to different abiotic stresses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
99(25):15898-15903.
Goto, F., T. Yoshihara, N. Shigemoto, S. Toki, F. Takaiwa.
1999. Iron fortification of rice seed by the soybean
ferritin gene. Nat. Biotechnol. 17:282-286.
Hiei, Y. and T. Komari. 1996. Stable inheritance of transgenes
in rice plants transformed by Agrobacterium
tumefaciens. Proceedings of the Third Rice Genetic
Symposium, Manila Philippines 16-20 Oct. p. 131-142.
Hiei, Y., S. Ohta, T. Komari, and T. Kumashiro. 1994. Efficient
transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated
by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of T-DNA. Plant J. 6:1-11.
Hiei, Y., T. Komari, and T. Kubo. 1997. Transformation of
rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol.
Biol. 35:205-218.
Hoekema, A., P.W. Roelvink, P.J.J. Hooykaas, and R.A.
Schilperoort. 1984. Delivery of T-DNA from the Agrobacterium
tumefaciens chromosome into plant cells.
EMBO J. 3(11):2485-2490.
Jin, W-Z., W. Shao-min, X. Min, D. Rui-jun, W. Ping. 2004.
Characterization of enhancer trap and gene trap
harboring Ac/Ds transposon in transgenic rice. Journal
of Zhejiang University Science 5(4):390-399.
Ling, H.Q., D. Kriseleit, and M.W. Ganal. 1998. Effect of
ticarcilin/potassium clavulanate on callus growth and
shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation
of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Plant
Cell Rep. 17:843-847.
Mafthuchah, I.H. Slamet-Loedin, dan H. Aswidinnor.
2002. Pengujian berbagai metode transformasi pada
padi Cisadane melalui Agrobacterium tumefaciens.
Kongres III Konsorsium Bioteknologi Indonesia dan
Seminar Bioteknologi.
Mei, L., S. Zong-Siu, Z. Jie, X. Tong, H. Garye, and L.
Matteo. 2004. Enhancing rice resistance to fungal
pathogens by transformation with cell wall degrading
enzyme genes from Trichoderma atroviride. Journal of
Zhejiang University Science 5(2):133-136.
Nishizawa, Y., Z. Nishio, K. Nakazono, M. Soma, E. Nakajima,
M. Ugaki, and T. Hibi. 1999. Enhanced resistance
to blast (Magnaporthe grisea) in transgenic rice by
constitutive expression of rice chitinase. Theor. Appl.
Genet. 99:383-390.
Rachmawati, D., T. Mori, T. Hosaka, F. Takaiwa, E. Inoue,
and H. Anzai. 2004. Production and characterization of
recombinant human lactoferrin in transgenic Javanica
rice cv Rojolele. 4th International Crop Science
Congress.
Rahmawati, S. dan I.H. Slamet-Loedin. 2004. Konstruksi
vektor biner mengandung gen hybrid cryIB-cryIAa untuk
transformasi Agrobacterium tanaman padi. Biota
9:67-73.
Rashid, H., S. Yokoi, K. Toriyama, and K. Hinata. 1996.
Transgenic plant production mediated by Agrobacterium
in Indica rice. Plant Cell Re. 15:727-730.
Rohila, J.S., R.K. Jain, and R. Wu. 2002. Agrobacteriummediated
transformation of Basmati rice to express the
barley HVAI gene for enhance tolerance to abiotik
stress. Rice Genetic Newsletters 18.
Saharan, V., R.C. Yadav, N.R. Yadav, and K. Ram. 2004.
Studies on improved Agrobacterium-mediated transformation
in two indica rice (Oryza sativa L.). African
Journal of Biotechnology 3(11):572-575.
Sheng, J. and V. Citovski. 1996. Agrobacterium-plant cell
DNA transport: Have virulence proteins, will travel. The
Plant Cell 8:1699-1710.
Slamet-Loedin, I.H. 1994. Transformasi genetik pada
tanaman: Beberapa teknik dan aspek penting. Hayati
1(2):66-67.
Slamet-Loedin, I.H., W. Rahayu, S. Hutajulu, dan J.
Wibowo. 1997a. Penggunaan dua strain Agrobacterium
tumefaciens supervirulen untuk ko-kultivasi tanaman
padi kultivar Cisadane dan Rojolele. Prosiding Seminar
Perhimpunan Bioteknologi Indonesia. Surabaya, 12-14
Maret 1997. hlm. 140-148.
Slamet-Loedin, I.H., M. Firdausi, A.S. Rahayu, dan P.D.
Tjondronegoro. 1997b. Pengaruh pemotongan skutelum
dan jenis bahan pemadat terhadap pembentukan
kalus embriogenik dan regenerasi tanaman dari
beberapa kultivar tanaman padi. Prosiding Seminar
Perhimpunan Bioteknologi Indonesia. Surabaya, 12-14
Maret 1997. hlm. 203-210.
Tang, H., Z. Ren, and G. Krezal. 2000. An evaluation of
antibiotics for the elimination of Agrobacterium tumefaciens
from walnut somatic embryos and for the effects
on the proliferation of somatic embryos and regeneration
of transgenic plants. Plant Cell Rep. 19:881-887.
Tinland, B. 1996. The integration of T-DNA into plant
genomes. Trends Plant Sci. 1(6):178-184.
Toki, S. 1997. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated
transformation in rice. Plant Mol. Biol. Rep. 15(1):16-21.
Torisky, R.S., L. Kovacs, S. Avdiushko, J.D. Newman,
A.G. Hunt, and G.B. Collins. 1997. Development of a
binary vector system for plant transformation based on
supervirulent Agrobacterium tumefaciens strain Chry5.
Plant Cell Rep. 17:102-108.
Vain, P., A.S. Afolah, B. Worland, and J.W. Snape. 2003.
Transgene behaviour in populations of rice plants
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
45
transformed using a new dual binary vector system:
pGreen/pSoup. Theor. Appl. Genet. 107:210-217.
Vasconcelos, M., K. Datta, N. Oliva, M. Khalekuzzaman,
L. Torizzo, S. Krishnan, M. Oleivera, F. Goto, and
S.K. Datta. 2003. Increased iron and zink accumulation
in transgenic rice with the ferritin gene. Plant Sci.
164:371-378.
Walkerpeach, C.R. and J. Velten. 1994. Agrobacteriummediated
gene transfer to plant cells: Cointegratee and
binary vector system. Plant Mol. Biol. Man. B1:1-19.
Wu, G., H. Cui, G. Ye, Y. Xia, R. Sardana, X. Cheng, Y. Li,
I. Altosaar, and Q. Shu. 2002. Inheritanceand expression
of the cryIAb gene in Bt (Bacillus thuringiensis)
transgenic rice. Theor. Appl. Genet. 104:727-734.
Yara, A., M. Otani, K. Kusumi, O. Matsuda, T. Shimada,
and K. Iba. 2001. Production of transgenic Japonica
rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the
Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnol.
18(4):305-310.
Ye, X., S. A-Babili, A. Kloti, J. Zhang, P. Lucca, P. Beyer,
and I. Potrykus. 2000. Engineering the provitamin A
(β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free)
rice endosperm. Science 287:303-305.
Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
Menggunakan Transformasi Agrobacterium
Syamsidah Rahmawati
Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Bogor KM 46, Cibinong 16911
ABSTRACT
Development Status of Rice Genetic Improvement using
Agrobacterium Transformation. Syamsidah Rahmawati.
Genetic transformation of rice becomes an important research
area in recent years. Rice is staple food for almost
half of world population and has been extensively used as a
plant model system for monocotyledonous plant. Compare
to direct DNA transfer techniques (PEG, electroporation, and
DNA bombardment), Agrobacterium tumefaciens-mediated
transformation was considered to be more advantageous
because it is easy to handle, integration and segregation
pattern are more predictable, and the likelihood to get transgenic
plant with low copy number is high, thus decreasing
gene silencing phenomena. Various important genes have
been introduced into rice genome via Agrobacterium
transformation. A number of important factors affecting the
Agrobacterium transformation and the application of this
technique in the next future will be discussed.
Key words: Rice, genetic improvement, Agrobacterium
transformation.
PENDAHULUAN
Padi merupakan komoditi penting karena merupakan
makanan pokok hampir setengah penduduk
dunia di mana sebagian besar berasal dari negara berkembang
termasuk Indonesia. Penyediaan beras bagi
penduduk dunia yang tumbuh pesat merupakan tantangan
berat. Ketersediaan pangan harus dipenuhi dalam
kondisi di mana lahan subur berkurang setiap tahun,
ketersediaan air terbatas, dan ada serangan hama
penyakit. Untuk mengantisipasi ketersediaan dan
menjaga ketahanan pangan secara berkesinambungan
perlu dikembangkan varietas tanaman yang mempunyai
kemampuan adaptasi yang baik dengan daya
hasil tinggi, kualitas biji dan kandungan nutrisi baik,
serta tahan terhadap cekaman hama penyakit.
Upaya perbaikan sifat-sifat penting tanaman
telah dimulai sejak manusia mengenal cara bercocok
ta-nam dengan melakukan persilangan dan seleksi
be-nih. Penemuan gen, yaitu penentu sifat yang
diwaris-kan pada turunan berikutnya oleh Gregor
Mendel pada tahun 1866 dilanjutkan dengan berbagai
penemuan berikutnya di mana gen dapat diisolasi,
Hak Cipta  2006, BB-Biogen
ditransfer, dan diekspresikan dalam sel lain telah
membuka peluang yang besar dalam upaya
perbaikan sifat genetik ta-naman. Penerapan
teknologi transfer gen ini memung-kinkan penyisipan
hanya gen-gen penting saja, sehing-ga sifat lain
diharapkan tidak berubah.
Pada tanaman padi, secara garis besar ada dua
teknik transfer gen yang telah berhasil diterapkan,
yaitu transfer gen secara langsung (misalnya dengan
senyawa kimia polyethylene glycol (PEG), alat elektroporator,
atau penembak DNA), atau secara tidak langsung
dengan menggunakan bantuan bakteri tanah
Agrobacterium tumefaciens (Slamet-Loedin 1994). Masing-
masing teknik memiliki kelemahan dan
keunggul-an. Namun, adanya kecenderungan teknik
transfer DNA secara langsung menyisipkan DNA
dengan jum-lah salinan yang banyak menyebabkan
teknik transfor-masi Agrobacterium menjadi alternatif
pilihan. Sema-kin banyak jumlah salinan gen yang
disisipkan maka ekspresi gen kurang stabil akibat dari
adanya pem-bungkaman gen dan proses penyusunan
kembali (rearrangement) semakin tinggi yang
mengakibatkan ekspresi gen kurang stabil (Dai et al.
2001).
Teknik transformasi Agrobacterium memiliki keunggulan,
antara lain (1) efisiensi transformasi dengan
salinan gen tunggal lebih tinggi dan (2) dapat dilakukan
dengan peralatan laboratorium yang sederhana.
Gen dengan salinan tunggal lebih mudah dianalisa
dan biasanya bersegregasi mengikuti pola pewarisan
Mendel. Namun, keberhasilan transformasi Agrobacterium
masih terbatas pada genotipe tanaman tertentu.
Secara alami A. tumefaciens hanya menginfeksi
tanaman dari kelompok dikotil (biji berkeping dua),
sehingga keberhasilan transformasi Agrobacterium pada
awalnya hanya terbatas pada kelompok tanaman
dikotil. Penelitian secara intensif dan mendasar telah
membuahkan pemahaman yang baik mengenai biologi
dan mekanisme transfer gen A. tumefaciens.
Keberhasilan transformasi gen pada tanaman padi
(monokotil) menggunakan Agrobacterium pertama
kali dilaporkan oleh Hiei et al. (1994;1997). Manipulasi
berbagai faktor penting menentukan keberhasilan
transformasi. Saat ini berbagai kultivar tanaman padi
telah berhasil ditransformasi menggunakan Agro-
Jurnal AgroBiogen 2(1):36-44
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
37
bacterium (Toki 1997; Yara et al. 2001; Saharan et al.
2004).
Di Indonesia, penelitian mengenai manipulasi
ge-netik padi telah dimulai sejak tahun 1995. Pada
awal-nya teknik transfer gen yang digunakan adalah
penem-bakan DNA. Baru pada tahun 1996 mulai
dirintis pe-ngembangan sistem transformasi
Agrobacterium untuk padi jenis indica dan javanica
yang banyak ditanam di Indonesia (Slamet-Loedin et
al. 1997a), namun hingga saat ini hanya padi kultivar
Rojolele yang sudah berhasil ditransformasi.
Beberapa gen terutama untuk ketahanan terhadap
hama penggerek batang kuning, penyakit yang
disebabkan oleh jamur, dan toleran ke-keringan telah
berhasil disisipkan dan sedang dieva-luasi ekspresi
dan fungsinya. Transformasi genetika sangat penting
dan merupakan alternatif pilihan dalam mengatasi
masalah-masalah yang tidak dapat diatasi dengan
teknik pemuliaan tanaman.
Di dalam tulisan ini akan dibahas mengenai penerapan
teknik transformasi Agrobacterium untuk
memperbaiki sifat genetik tanaman padi, aspek penting
yang mempengaruhi keberhasilan transformasi,
gen yang telah berhasil diintroduksi pada tanaman padi,
dan prospek pemanfaatan teknik ini di masa yang
akan datang.
BIOLOGI DAN MEKANISME TRANSFORMASI
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
A. tumefaciens merupakan bakteri tanah gram
positif yang bersifat fitopatogen pada tanaman dikotil.
Bakteri ini, secara alami mempunyai kemampuan untuk
mentransfer potongan DNA-nya yang kemudian dikenal
dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom
tanaman dan menyebabkan terbentuknya tumor
(crown gall). Tumor ini merupakan mesin penghasil
makanan atau sebagai sumber karbon bagi
Agrobacte-rium.
Ada tiga komponen genetik penting terlibat dalam
proses pembentukan tumor. Pertama, gen virulen
kromosom (chromosomal virulence disingkat chv),
yang terdapat pada kromosom Agrobacterium dan
berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman.
Kedua, sekelompok gen virulen (vir) yang terdapat
dalam plasmid Ti yang berukuran besar (∼200 kb)
yang berperan dalam menginduksi transfer dan
integrasi T-DNA. Dan komponen ketiga adalah daerah
T-DNA yang juga terletak pada plasmid Ti. Daerah
T-DNA, dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right
border), mengandung gen penting bagi
Agrobacterium. Di dalam T-DNA terdapat gen iaaH,
iaaM, dan ipt yang menyandikan enzim-enzim penting
dalam biosintesis auksin dan sitokinin, yaitu zat
penting untuk pembe-lahan sel, sehingga terjadi
pembelahan sel yang tidak terkontrol dan
menyebabkan terbentuknya tumor. Di samping itu, TDNA
juga mengandung gen yang ber-peran dalam
sintesis dan sekresi opin yang penting untuk
dikonsumsi oleh Agrobacterium.
Bakteri masuk ke dalam jaringan tanaman melalui
luka. Jaringan tanaman dikotil yang terluka
meng-hasilkan senyawa fenolik (asetosiringon) dan
monosa-karida (glukosa, galaktosa) yang
menginduksi trans-kripsi sederetan gen vir dan
berakhir dengan penyisip-an gen-gen yang ada pada
daerah T-DNA. Mekanisme integrasi T-DNA ke dalam
genom tanaman secara mendetail dapat dilihat dalam
tulisan Tinland (1996), Sheng dan Citovsky (1996),
atau de la Riva et al. (1998). Mekanisme transfer gen
oleh bakteri A. tumefa-ciens dirangkum pada Gambar
1.
Kemampuan Agrobacterium ini kemudian
diman-faatkan untuk menyisipkan gen bermanfaat ke
dalam tanaman. Selanjutnya gen-gen yang berperan
dalam sintesis hormon dan opin dihilangkan dan
diganti de-ngan gen bermanfaat untuk perbaikan sifat
tanaman. Berdasarkan hasil penelitian Hoekema et al.
(1984) di-ketahui bahwa T-DNA dapat ditransfer
meskipun ter-letak pada plasmid yang berbeda.
Penemuan inilah yang mendasari penggunaan sistem
plasmid ganda (binary vector). Dibandingkan dengan
sistem yang la-ma (cointegrate), sistem vektor biner
adalah yang pa-ling banyak digunakan saat ini karena
plasmid yang mengandung T-DNA menjadi lebih kecil
dan lebih mu-dah dimanipulasi secara in vitro. Dalam
sistem ini di-gunakan dua vektor (Gambar 2), satu
mengandung kelompok gen vir (plasmid Ti) dan
vektor lain me-ngandung T-DNA dengan gen yang
disisipkan (Walkerpeach dan Velten 1994).
Selanjutnya, penam-bahan gen virG pada plasmid
biner dilaporkan dapat meningkatkan efisiensi
transformasi. Plasmid biner yang mendapat tambahan
gen vir ini disebut sebagai plasmid super biner (super
binary vector) (Torisky et al. 1997).
FAKTOR PENTING YANG MEMPENGARUHI
KEBERHASILAN TRANSFORMASI AGROBACTERIUM
Genotipe dan Jaringan Tanaman/Eksplan
Azhakanandam et al. (2000) melaporkan bahwa
keberhasilan transformasi Agrobacterium sangat bergantung
pada genotipe tanaman padi yang digunakan
sebagai materi penelitian tidak peduli apakah dari
kelompok japonica, indica atau javanica. Beberapa
genotipe padi sangat sulit ditransformasi dengan AgroJURNAL
AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
38
bacterium. Hal ini merupakan salah satu keterbatasan
penggunaan transformasi Agrobacterium. Genotipe
yang sangat responsif terhadap kultur jaringan cenderung
memberikan respon yang baik terhadap transformasi.
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
39
Gambar 1. Mekanisme transfer gen ke dalam tanaman oleh A. tumefaciens. Tahapan penting yang terjadi selama proses
transfer gen dijelaskan secara ringkas pada kotak 1-13. Beberapa tahapan masih belum diketahui secara pasti
(diberi tanda ?) atau baru merupakan hipotesis.
Sumber: de la Riva et al. (1998).
Gambar 2. Sistem vektor biner. Plasmid A dan B komplemen satu sama lain apabila keduanya berada
pada satu sel A. tumefaciens. T-DNA yang terdapat pada plasmid B akan ditransfer ke dalam
sel tanaman oleh protein yang disandi plasmid A.
DNA kromosom
Sel Agrobacterium tumefaciens
A
pTi
~ 170 kb
Daerah virulen
Daerah spesifisitas
inang
B
~ 20 kb
T-DNA
Daerah pemotongan
spesifik
chvA chvB
p
chvE
JURNAL AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
40
Di samping pemilihan genotipe tanaman, pemilihan
jaringan juga menentukan keberhasilan transformasi.
Jaringan yang baik digunakan sebagai bahan
transformasi adalah jaringan yang memberikan
respon yang baik terhadap kultur jaringan. Dari
berbagai ja-ringan (ujung tunas, akar, skutellum,
embrio yang be-lum masak, kalus yang diinduksi dari
akar dan sku-tellum, serta kultur suspensi sel yang
diinduksi dari skutellum) yang telah dicoba, kalus dari
jaringan sku-tellum benih masak menghasilkan
jumlah transforman paling tinggi (23%) (Hiei et al.
1994) sehingga paling banyak digunakan hingga saat
ini. Ukuran skutelum dapat mempengaruhi efisiensi
transformasi dengan meningkatkan kemampuan
pembentukan kalus em-briogenik secara nyata
(Slamet-Loedin et al. 1997b). Pemilihan genotipe yang
sistem regenerasinya sudah diketahui dengan baik
merupakan tahap awal yang menentukan
keberhasilan transformasi.
Strain Agrobacterium dan Plasmid/Vektor
Pemilihan strain Agrobacterium dan vektor
sangat mempengaruhi efisiensi transformasi. Salah
satu kele-mahan transformasi Agrobacterium adalah
terbatas-nya tanaman inang yang dapat diinfeksi.
Penggunaan A. tumefaciens yang super virulen
seperti, EHA 101, EHA 105, AGL1 dikombinasikan
dengan vektor biner atau A. tumefaciens strain biasa
(LBA 4404) dikombi-nasikan dengan vektor super
biner ditujukan untuk memperluas inang tanaman
yang dapat diinfeksi. Azhakanandam et al. (2000)
melaporkan bahwa A. tumefaciens strain LBA4404
yang membawa vektor super-biner (pTOK233 dengan
ekstra gen virB, C, dan G) sangat efektif
mentransformasi padi baik kelompok japonica,
indica, dan javanica dibandingkan dengan vektor
biner pTOK233 tanpa penambahan ekstra gen vir.
Asetosiringon dan pH
Senyawa fenolik asetosiringon merupakan sinyal
transkripsi gen vir yang berperan dalam mekanisme
transfer gen. Penambahan asetosiringon sangat penting
untuk transformasi tanaman padi karena tanaman
padi tidak menghasilkan asetosiringon. Tanpa penambahan
asetosiringon transformasi tidak akan berhasil
meskipun menggunakan strain yang super virulen
atau vektor super biner (Rashid et al. 1996).
Konsentrasi optimum dan umum digunakan dalam
transformasi Agrobacterium adalah 100 μM. Namun,
untuk transfor-masi padi rekalsitran (misalnya padi
dari kelompok Indica HKR-46 dan -126) penambahan
asetosiringon konsentrasi tinggi (400 μM) pada media
pertumbuhan Agrobacterium dan ko-kultivasi perlu
dilakukan untuk meningkatkan keberhasilan
transformasi (Saharan et al. 2004). Selain itu, kondisi
pH juga mempengaruhi ekspresi gen vir. Meskipun
gen vir dapat diekspresikan pada pH 5,0-5,8, kondisi
pH 5,2 adalah yang paling baik dan umum digunakan.
Kondisi Infeksi dan Ko-kultur
Berbagai modifikasi dilakukan pada saat prainfeksi,
infeksi, dan ko-kultivasi untuk meningkatkan
efisiensi transformasi. Sebelum inokulasi, Agrobacterium
ditumbuhkan pada media YEP atau media AB
yang mengandung asetosiringon. Konsentrasi bakteri
yang digunakan bervariasi antara 0,5-2 pada OD600
(Azhakanandam et al. 2000; Dai et al. 2001; Saharan et
al. 2004). Bakteri yang digunakan untuk menginfeksi
sel tanaman sebaiknya bakteri yang sedang tumbuh
aktif (fase logaritmik). Bakteri yang sudah ditumbuhkan
selama satu malam disubkultur dan ditumbuhkan
kembali selama 2-3 jam hingga mencapai kerapatan
sel yang diinginkan (OD600 = 0,4-0,5). Pada
konsentrasi yang lebih tinggi, populasi bakteri lebih
padat pada kalus sehingga menyulitkan saat
pencucian kalus.
Selain faktor kerapatan sel, perendaman kalus
dalam suspensi Agrobacterium selama 25 menit ditambah
perlakuan vakum selama 5 menit dapat meningkatkan
efisiensi transformasi (Mafthuchah et al.
2002).
Antibiotik untuk Eliminasi Agrobacterium
Setelah ko-kultivasi biasanya Agrobacterium dieradikasi
dengan merendam kalus dalam larutan antibiotik.
Selanjutnya kalus ditanam pada media seleksi
yang selain mengandung agen penyeleksi juga mengandung
antibiotik. Bahkan terkadang penggunaan
antibiotik dilanjutkan pada media regenerasi (Yara et
al. 2001) untuk menghindari berkembangnya
Agrobac-terium. Kejadian di mana bakteri tidak
terdeteksi se-lama di media seleksi yang mengandung
antibiotik, namun muncul kembali setelah
dipindahkan pada media regenerasi yang tidak
mengandung antibiotik kadang terjadi.
Masing-masing strain Agrobacterium mempunyai
sensitivitas yang berbeda-beda terhadap antibiotik
(Alsheikh et al. 2002), sehingga perlu pengujian awal
untuk menentukan jenis dan konsentrasi antibiotik
yang sesuai untuk membunuh Agrobacterium yang
digunakan. Antibiotik yang umum digunakan untuk
mengeliminasi Agrobacterium adalah carbenicilin dan
cefotaxim. Keduanya termasuk kelompok β-laktam
yang menghambat pembentukan dinding sel bakteri.
Namun, carbenicilin sensitif terhadap enzim β-laktamase
yang dihasilkan oleh bakteri sehingga kurang
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
41
efektif dalam mengeliminasi Agrobacterium pasca kokultivasi.
Sebaliknya, cefotaxime bersifat lebih resisten
terhadap β-lactamase, namun dapat menghambat
per-tumbuhan kalus, regenerasi tanaman dan mempengaruhi
efisiensi transformasi (Ling et al. 1998).
Tang et al. (2000) membandingkan efektifitas dari 4
jenis antibiotik (ampicilin, carbenicilin, cefotaxime,
dan timentin) pada berbagai konsentrasi (100–1000
mg/l) terhadap A tumefaciens strain C58C1 ATHV RifR
(derivatif dari EHA 101). Timentin merupakan kombinasi
antibiotik ticarcilin (golongan β-lactam) dengan
inhibitor β-laktamase asam klavulanat. Hasil pengujian
tersebut menunjukkan bahwa timentin (500 mg/l) paling
efektif mengeliminasi A. tumefaciens strain C58C1
dan tidak berpengaruh negatif terhadap regenerasi tanaman.
Kelebihan timentin lainnya adalah lebih toleran
terhadap cahaya. Namun sayang, jenis antibiotik
ini sulit ditemukan di Indonesia. Alternatif lain adalah
dengan pengeringan sel atau jaringan tanaman secara
perlahan pasca infeksi. Cheng et al. (2003) melaporkan
bahwa pengeringan dapat menekan
pertumbuhan Agrobacterium dan meningkatkan
efisiensi transfor-masi.
Media Induksi, Ko-kultivasi, dan Regenerasi
Media dasar yang umum digunakan untuk induksi
kalus, ko-kultivasi, dan seleksi adalah N6 sedangkan
untuk media regenerasi adalah media MS (Hiei et al.
1994; Rashid et al. 1996; Toki 1997; Yara et al. 2001;
Cao et al. 2004). Penambahan casamino acids dan
prolin dilaporkan dapat meningkatkan kemampuan
re-generasi tanaman dan dapat menghasilkan
tanaman transgenik dalam waktu 2 bulan sejak
induksi kalus (Toki 1997). Kemampuan regenerasi
yang sama (12-31%) juga diperoleh pada tiga
subspesies padi japo-nica, indica, dan javanica
menggunakan media dasar LS untuk induksi kalus,
ko-kultivasi, dan seleksi (Azha-kanandam et al. 2000;
Slamet-Loedin et al. 1997a). Kemampuan regenerasi
pasca transformasi pada beberapa kultivar padi
sangat menurun akibat adanya kecenderungan
nekrosis. Dey et al. (2003) melaporkan bahwa
penambahan antinecrotic (40 mg/l L-cystein, 5 mg/l
perak nitrat, dan 15 mg/l ascorbic acid) dapat
mengurangi necrosis pasca infeksi Agrobacterium dan
meningkatkan kemampuan regenerasi tanaman. Penambahan
bahan pemadat phytagel 0,2% pada media
induksi kalus dan 0,5% pada media regenerasi meningkatkan
jumlah kalus embriogenik dan kemampuan
regenerasi berbagai kultivar tanaman padi baik
dari kelompok javanica, japonica, dan indica (Slamet-
Loedin et al. 1997b). Penggunaan phytagel lebih ekonomis
dibandingkan dengan agarose tipe I (Sigma)
yang umum digunakan pada kultur jaringan tanaman
padi karena selain harganya jauh lebih murah pemakaiannya
juga lebih sedikit.
Bahan Penyeleksi
Higromisin (hpt) dan fosfinotrisin (bar) merupakan
dua agen penyeleksi yang digunakan secara luas
pada tanaman padi (Hiei et al. 1994; Rashid et al.
1996; Toki 1997; Yara et al. 2001; Vain et al. 2003;
Saharan et al. 2004; Jin et al. 2004). Konsentrasi yang
umum digu-nakan adalah 50 mg/l higromisin atau 5
mg/l fosfinotri-sin. Namun pada konsentrasi ini
terkadang masih memungkinkan adanya tanaman
yang escape, yaitu tanaman tahan higromisin atau
fosfinotrisin tapi tidak mengandung gen target.
Berdasarkan pengalaman di laboratorium,
peningkatan konsentrasi agen penyelek-si secara
bertahap dapat menekan munculnya tanam-an
escape. Kanamisin (nptII) atau G418 juga dapat digunakan
sebagai agen penyeleksi pada padi, namun
penggunaannya sangat terbatas karena dilaporkan
dapat menghambat pertumbuhan sel (Azhakanandam
et al. 2000).
Ekspresi dan Stabilitas Gen
Gen yang disisipkan ke dalam genom tanaman
harus dapat diekspresikan sehingga menghasilkan
protein yang diinginkan serta harus stabil diwariskan
ke generasi berikutnya. Gen-gen yang diekspresikan
pada tanaman, pada awalnya, adalah gen-gen asli dari
sumbernya (bakteri, jamur, hewan, tanaman), namun
kebanyakan ekspresi dari gen tersebut di dalam tanaman
sangat rendah. Hal ini antara lain disebabkan
oleh penggunaan kodon yang tidak sesuai. Oleh karena
itu, modifikasi, penggunaan kodon yang sesuai dengan
tanaman target telah umum dilakukan untuk
meningkatkan ekspresi gen di dalam tanaman. Selain
itu, penambahan enhancer dikombinasikan dengan
penggunaan promoter kuat atau promoter spesifik dapat
meningkatkan ekspresi gen pada tanaman.
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa apabila
gen telah terintegrasi pada genom tanaman,
maka gen tersebut akan stabil diwariskan ke generasi
berikutnya. Hiei dan Komari (1996) melaporkan bahwa
transgen stabil diwariskan hingga generasi ke-4.
Hal yang sama juga dilaporkan oleh Wu et al. (2002)
di mana transgen stabil diwariskan hingga generai ke-
6. Namun, Rashid et al. (1996) melaporkan tentang
ada-nya kemungkinan terjadinya pembungkaman
gen. Pembungkaman gen adalah salah satu fenomena
yang menyebabkan terjadinya kegagalan dalam
mengeks-presikan gen. Hingga saat ini, mekanisme
yang menye-babkan terjadinya ketidakstabilan
JURNAL AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
42
integrasi dan eks-presi gen masih belum jelas
dimengerti. Cao et al. (2004) menyarankan
penggunaan promoter yang ber-beda untuk masingmasing
kaset ekspresi, untuk menghindari terjadinya
pembungkaman gen pada tahap transkripsi
(transcriptional silencing).
GEN YANG TELAH BERHASIL DIINTRODUKSI KE
DALAM GENOM TANAMAN PADI MENGGUNAKAN
TRANFORMASI AGROBACTERIUM
Saat ini berbagai gen bermanfaat telah berhasil
disisipkan ke dalam berbagai kultivar tanaman padi
baik sebagai gen tunggal maupun gen ganda dengan
menggunakan transformasi Agrobacterium. Pada
awalnya introduksi hanya terbatas pada gen-gen penyandi
sifat ketahanan terhadap hama atau penyakit,
yang dianggap sangat menguntungkan pengusaha
tani. Namun beberapa tahun terakhir ini telah dikembangkan
tanaman padi yang memiliki sifat yang
meng-untungkan bagi konsumen. Golden rice, yaitu
beras yang berwarna kuning keemasan karena
mengekspre-sikan pro-vitamin A β-karoten (Ye et al.
2000) dan beras kaya akan kandungan zat besi (Goto
et al. 1999) adalah dua contoh populer upaya
perbaikan nutrisi padi.
Saat ini, pencarian gen-gen yang berperan dalam
menentukan sifat tahan kekeringan (kekurangan air),
dan introduksi gen tersebut ke dalam genom padi,
serta evaluasi ketahanan tanaman transgenik, sedang
giat dilakukan. Hal ini dilakukan untuk mengantisipasi
keadaan di mana ketersediaan lahan subur yang semakin
berkurang. Selain itu, juga ada upaya pemanfaatan
sel tanaman padi untuk produksi bahan obat,
meskipun mendapat banyak tantangan dari berbagai
kalangan. Berbagai gen yang telah berhasil diintroduksi
ke dalam genom tanaman padi disajikan pada
Tabel 1.
PROSPEK
Tanaman padi transgenik yang mengandung berbagai
gen penting seperti gen tahan penggerek
batang, penyakit blas, hawar daun, kekeringan,
salinitas, dan herbisida. Di samping itu juga dihasilkan
tanaman padi dengan daya hasil tinggi, dan
kandungan zat besi dan vitamin A tinggi
menggunakan transformasi Agrobac-terium. Saat ini,
transformasi Agrobacterium sudah di-manfaatkan
lebih luas pada berbagai kultivar tanaman padi
kelompok japonica, indica maupun javanica.
Meskipun demikian tidak semua genotipe padi
berhasil ditransformasi menggunakan teknik transformasi
Agrobacterium yang dikembangkan saat ini.
Beberapa kultivar padi komersial, seperti IR64 dan
Tabel 1. Beberapa gen yang telah diintroduksi ke dalam tanaman menggunakan transformasi Agrobacterium.
Gen Asal Promoter Sifat sasaran Varitas padi Pustaka
cryIAb, cryIAc Bacillus thuringiensis Ubi, CaMV 35S,
Brassica Bp10
Tahan PBK dan PBP Nipponbare
(Japonica)
Cheng et al. (1998)
ferritin Kedelai GluB-1 Padi mengandung zat
besi dan zink
Indica (IR68144) Goto et al. (1999);
Vasconcelos et al. (2003)
psy, lyc, crt1 Bunga daffodil
Bakteri Erwinia
uredovora
Gt1, 35S CaMV
35S CaMV
Padi mengandung provitamin
A
Japonica (TP 309) Ye et al. (2000)
rhLF (lactoferrin) Manusia Ubiquitin jagung Padi mengandung
lactoferin
Javanica (Rojolele) Rachmawati et al. (2004)
ech42, nag70, glue48 Trichoderma atriviride Act1 Tahan Rhizoctonia
solani dan Magnaporte
grisea
Ishikari-shiroge
(Japonica)
Mei et al. (2004)
cryIB-cryIAa hybrid Bt Ubiquitin jagung Tahan PBK Javanica (Rojolele) Rahmawati dan Slamet-
Loedin (2004)
VHb dan EPSPS Bakteri Vitreoscilla dan
Salmonella typhimurium
Pistil spesifik dari
kentang dan
CaMV35S
Hasil tinggi dan tahan
herbisida
Japonica (Xiushui-11,
Qiufeng, Youfeng,
dan Hanfeng)
Cao et al. (2004)
chitinaseI Padi CaMV Tahan jamur penyebab
blas Magnaporthe
grisea dan Rhizoctonia
solani
Indica (vaidehi, tulsi) Nishizawa et al. (1999)
Hva1 Barley Promoter
terinduksi ABA,
Promoter
konstitutive
actin1 padi
Osmoprotektan Indica (Basmati) Rohila et al. (2002)
otsA-otsB, Bakteri E. coli Promoter
terinduksi ABA
dan stres, rbcS
Tahan salinitas dan
kekeringan
Indica (PB-1) Garg et al. (2002)
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
43
IR72 sangat rekalsitran terhadap transformasi
Agrobac-terium. Ditambah lagi tidak semua kultivar
dapat disil-angkan satu sama lain. Namun, dengan
adanya upaya pengembangan vektor super biner baru
(Toki 1997; Cao et al. 2004) yang lebih efektif ataupun
pengem-bangan sistem vektor biner rangkap (Vain et
al. 2003) dikombinasikan dengan penggunaan strain
Agrobac-terium yang sesuai, maka penggunaan
transformasi Agrobacterium akan lebih luas lagi di
masa menda-tang.
Keberhasilan penggunaan sistem vektor biner
rangkap akan sangat bermanfaat dalam upaya introduksi
multi gen di mana ukuran DNA yang disisipkan
dapat lebih banyak dan besar. Seperti sudah diketahui
bahwa beberapa sifat, seperti tahan kekeringan dan
daya hasil tinggi, ditentukan oleh banyak gen. Kebanyakan
dari gen-gen yang berperan dalam menentukan
sifat toleran kekeringan dan daya hasil tinggi belum
berhasil diidentifikasi hingga saat ini. Penemuan
gen-gen penentu sifat-sifat penting tersebut disertai
de-ngan penguasaan teknik transformasi yang tepat
di-harapkan dapat memenuhi kebutuhan pangan
yang akan terus meningkat.
Salah satu pendekatan yang lazim digunakan
saat ini untuk menemukan, mengisolasi, dan
identifikasi gen-gen yang menentukan sifat penting
pada tanaman adalah dengan membuat tanaman
mutan. Tanaman mutan dihasilkan dengan
menginsersikan elemen transposon (di antaranya
Ac/Ds) menggunakan trans-formasi Agrobacterium.
Dalam proses menghasilkan tanaman mutan tersebut,
penerapan teknik trans-formasi Agrobacterium lebih
menguntungkan karena dapat menghasilkan tanaman
yang mengandung salin-an gen tunggal dengan
efisiensi tinggi. Analisis tanam-an dengan jumlah
salinan gen tunggal lebih mudah dilakukan, sehingga
tanaman mengandung gen target dengan salinan
tunggal sangat diperlukan dalam studi biologi
molekuler dan dalam mempelajari fungsi gen
(functional genomic).
KESIMPULAN
Saat ini transformasi Agrobacterium telah
berhasil dilakukan pada berbagai kultivar padi
japonica, indica dan javanica. Pemilihan genotipe,
jaringan tanaman, umur eksplan, strain
Agrobacterium, vektor, konsentra-si asetosiringon dan
pH, kerapatan sel bakteri, lama dan suhu kokultivasi,
antibiotik, bahan penyeleksi, komposisi media kultur,
sangat penting dalam menen-tukan keberhasilan
transformasi. Pada beberapa ta-naman yang sangat
rekalsitran penggunaan konsen-trasi asetosiringon
dan bahan pemadat yang tinggi, pengeringan kalus
secara perlahan atau penambahan antinekrotik pasca
ko-kultivasi dapat meningkatkan efisiensi transformasi
secara nyata. Selain itu, pemi-lihan promoter,
penggunaan kodon yang sesuai, pe-nambahan
enhancer dapat meningkatkan ekspresi gen di dalam
tanaman. Saat ini berbagai gen, tunggal maupun
poligenik, telah berhasil diintroduksi ke dalam
tanaman padi dalam upaya perbaikan mutu genetik
padi dan dilaporkan stabil diturunkan ke gene-rasi
berikutnya. Kemampuan transformasi Agrobacte-rium
menghasilkan tanaman transgenik dengan salin-an
gen tunggal akan banyak dimanfaatkan untuk
mempelajari fungsi berbagai gen penting tanaman
padi pada masa mendatang.
DAFTAR PUSTAKA
Alsheikh, M.K., H.P. Suso, M. Robson, N.H. Battey, and A.
Watten. 2002. Appropriate choice of antibiotic and
Agrobacterium strain improves transformation of antibiotic-
sensitive Fragaria vesca and F.V. semperflorens.
Plant Cell Rep. 20:1173-1180.
Azhakanandam, K., M.S. McCabe, J.B. Power, K.C. Lowe,
E.C. Cocking, and M.R. Davey. 2000. T-DNA transfer,
integration, expression and inheritance in rice: Effects of
plant genotype and Agrobacterium super-virulence. J.
Plant Physiol. 157:429-439.
Bizily, S.P., C.L. Rugh, R.B. Maegher. 2000. Phytodetoxification
of hazardous organomercurials by genetically
engineered plants. Nat. Biotechnol. 18:213-217.
Cao, M.X., J.Q. Huang, Z.M. Wei, Q.H. Yao, C.Z. Wan, and
J.A. Lu. 2004. Engineering higher yield and herbicide
resistance in rice by Agrobacterium-mediated multiple
gene transformation. Crop Sci. 44:2206-2213.
Cheng, X., R. Sardana, H. Kaplan, and I. Altosaar. 1998.
Agrobacterium-transformed rice plants expressing
synthetic cryIAb and cryIAc genes are highly toxic to
striped stem borrer and yellow stem borrer. Appl. Biol.
Sci. 95(6):2767-2772.
Cheng, M., T. Hu, L. Jeanne, L. Chong-Nong, and E.F.
Joyce. 2003. Desiccation of plant tissues post-Agrobacterium
infection enhances T-DNA delivery and increases
stable transformation efficiency in wheat. In
Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 39(6):595-604.
Cohen, M.B. 2000. Bt rice: Practical steps to sustainable
use. International Rice Research Notes 25(2):4-10.
Dai, S., P. Zheng, P. Marmey, S. Zhang, W. Tian, S. Chen,
R.N. Beachy, and C. Fauquet. 2001. Comperative
analysis of transgenic rice plants obtained by Agrobacterium-
mediated transformation and particle bombardment.
Mol. Breed. 7:25-33.
de la Riva, A.G., J. Gonzalez-Cabrera, R. Vazquez-
Padron, and C. Arya-Pardo. 1998. Agrobacterium
tumefaciens: A natural tool for plant transformation.
JURNAL AGROBIOGEN VOL 2, NO. 1
44
Electronic Journal of Biotechnology 1(3) issue of
Dec 15.
Dey, M., H. Jiang, and R. Wu. 2003. Antinecrotic substances
improved regeneration frequency of transgenic
rice. Rice Genetics Newsletter 19:82-84.
Garg, A.K., J-K Kim, T.G. Owens, A.P. Ranwala, Y.D.
Choi, L.V. Kochian, and R.J. Wu. 2002. Trehalose
accumulation in rice plants confers high tolerance levels
to different abiotic stresses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
99(25):15898-15903.
Goto, F., T. Yoshihara, N. Shigemoto, S. Toki, F. Takaiwa.
1999. Iron fortification of rice seed by the soybean
ferritin gene. Nat. Biotechnol. 17:282-286.
Hiei, Y. and T. Komari. 1996. Stable inheritance of transgenes
in rice plants transformed by Agrobacterium
tumefaciens. Proceedings of the Third Rice Genetic
Symposium, Manila Philippines 16-20 Oct. p. 131-142.
Hiei, Y., S. Ohta, T. Komari, and T. Kumashiro. 1994. Efficient
transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated
by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of T-DNA. Plant J. 6:1-11.
Hiei, Y., T. Komari, and T. Kubo. 1997. Transformation of
rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol.
Biol. 35:205-218.
Hoekema, A., P.W. Roelvink, P.J.J. Hooykaas, and R.A.
Schilperoort. 1984. Delivery of T-DNA from the Agrobacterium
tumefaciens chromosome into plant cells.
EMBO J. 3(11):2485-2490.
Jin, W-Z., W. Shao-min, X. Min, D. Rui-jun, W. Ping. 2004.
Characterization of enhancer trap and gene trap
harboring Ac/Ds transposon in transgenic rice. Journal
of Zhejiang University Science 5(4):390-399.
Ling, H.Q., D. Kriseleit, and M.W. Ganal. 1998. Effect of
ticarcilin/potassium clavulanate on callus growth and
shoot regeneration in Agrobacterium-mediated transformation
of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Plant
Cell Rep. 17:843-847.
Mafthuchah, I.H. Slamet-Loedin, dan H. Aswidinnor.
2002. Pengujian berbagai metode transformasi pada
padi Cisadane melalui Agrobacterium tumefaciens.
Kongres III Konsorsium Bioteknologi Indonesia dan
Seminar Bioteknologi.
Mei, L., S. Zong-Siu, Z. Jie, X. Tong, H. Garye, and L.
Matteo. 2004. Enhancing rice resistance to fungal
pathogens by transformation with cell wall degrading
enzyme genes from Trichoderma atroviride. Journal of
Zhejiang University Science 5(2):133-136.
Nishizawa, Y., Z. Nishio, K. Nakazono, M. Soma, E. Nakajima,
M. Ugaki, and T. Hibi. 1999. Enhanced resistance
to blast (Magnaporthe grisea) in transgenic rice by
constitutive expression of rice chitinase. Theor. Appl.
Genet. 99:383-390.
Rachmawati, D., T. Mori, T. Hosaka, F. Takaiwa, E. Inoue,
and H. Anzai. 2004. Production and characterization of
recombinant human lactoferrin in transgenic Javanica
rice cv Rojolele. 4th International Crop Science
Congress.
Rahmawati, S. dan I.H. Slamet-Loedin. 2004. Konstruksi
vektor biner mengandung gen hybrid cryIB-cryIAa untuk
transformasi Agrobacterium tanaman padi. Biota
9:67-73.
Rashid, H., S. Yokoi, K. Toriyama, and K. Hinata. 1996.
Transgenic plant production mediated by Agrobacterium
in Indica rice. Plant Cell Re. 15:727-730.
Rohila, J.S., R.K. Jain, and R. Wu. 2002. Agrobacteriummediated
transformation of Basmati rice to express the
barley HVAI gene for enhance tolerance to abiotik
stress. Rice Genetic Newsletters 18.
Saharan, V., R.C. Yadav, N.R. Yadav, and K. Ram. 2004.
Studies on improved Agrobacterium-mediated transformation
in two indica rice (Oryza sativa L.). African
Journal of Biotechnology 3(11):572-575.
Sheng, J. and V. Citovski. 1996. Agrobacterium-plant cell
DNA transport: Have virulence proteins, will travel. The
Plant Cell 8:1699-1710.
Slamet-Loedin, I.H. 1994. Transformasi genetik pada
tanaman: Beberapa teknik dan aspek penting. Hayati
1(2):66-67.
Slamet-Loedin, I.H., W. Rahayu, S. Hutajulu, dan J.
Wibowo. 1997a. Penggunaan dua strain Agrobacterium
tumefaciens supervirulen untuk ko-kultivasi tanaman
padi kultivar Cisadane dan Rojolele. Prosiding Seminar
Perhimpunan Bioteknologi Indonesia. Surabaya, 12-14
Maret 1997. hlm. 140-148.
Slamet-Loedin, I.H., M. Firdausi, A.S. Rahayu, dan P.D.
Tjondronegoro. 1997b. Pengaruh pemotongan skutelum
dan jenis bahan pemadat terhadap pembentukan
kalus embriogenik dan regenerasi tanaman dari
beberapa kultivar tanaman padi. Prosiding Seminar
Perhimpunan Bioteknologi Indonesia. Surabaya, 12-14
Maret 1997. hlm. 203-210.
Tang, H., Z. Ren, and G. Krezal. 2000. An evaluation of
antibiotics for the elimination of Agrobacterium tumefaciens
from walnut somatic embryos and for the effects
on the proliferation of somatic embryos and regeneration
of transgenic plants. Plant Cell Rep. 19:881-887.
Tinland, B. 1996. The integration of T-DNA into plant
genomes. Trends Plant Sci. 1(6):178-184.
Toki, S. 1997. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated
transformation in rice. Plant Mol. Biol. Rep. 15(1):16-21.
Torisky, R.S., L. Kovacs, S. Avdiushko, J.D. Newman,
A.G. Hunt, and G.B. Collins. 1997. Development of a
binary vector system for plant transformation based on
supervirulent Agrobacterium tumefaciens strain Chry5.
Plant Cell Rep. 17:102-108.
Vain, P., A.S. Afolah, B. Worland, and J.W. Snape. 2003.
Transgene behaviour in populations of rice plants
2006 S. RAHMAWATI: Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi
45
transformed using a new dual binary vector system:
pGreen/pSoup. Theor. Appl. Genet. 107:210-217.
Vasconcelos, M., K. Datta, N. Oliva, M. Khalekuzzaman,
L. Torizzo, S. Krishnan, M. Oleivera, F. Goto, and
S.K. Datta. 2003. Increased iron and zink accumulation
in transgenic rice with the ferritin gene. Plant Sci.
164:371-378.
Walkerpeach, C.R. and J. Velten. 1994. Agrobacteriummediated
gene transfer to plant cells: Cointegratee and
binary vector system. Plant Mol. Biol. Man. B1:1-19.
Wu, G., H. Cui, G. Ye, Y. Xia, R. Sardana, X. Cheng, Y. Li,
I. Altosaar, and Q. Shu. 2002. Inheritanceand expression
of the cryIAb gene in Bt (Bacillus thuringiensis)
transgenic rice. Theor. Appl. Genet. 104:727-734.
Yara, A., M. Otani, K. Kusumi, O. Matsuda, T. Shimada,
and K. Iba. 2001. Production of transgenic Japonica
rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the
Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnol.
18(4):305-310.
Ye, X., S. A-Babili, A. Kloti, J. Zhang, P. Lucca, P. Beyer,
and I. Potrykus. 2000. Engineering the provitamin A
(β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free)
rice endosperm. Science 287:303-305.